DNA复制的基本规律

1. DNA 以半保留复制方式进行复制：子代 DNA 中保留了亲代的全部遗传信息，亲代与子代 DNA 之间碱基序列高度一致
2. DNA 复制从起点双向进行：
   • 原核生物一个起点
   • 真核生物多个起点，每个起点起始的 DNA 复制区称为复制子
   • 双向复制在每个复制子两端形成 2 个复制叉
3. DNA复制以半不连续方式进行
   • DNA 聚合酶只能从 5′ → 3′ 聚合，故必然有一条链不能连续复制
   • 前导链连续复制，后随链不连续复制
   • 冈崎片段：后随链复制延长和解链方向不同
4. DNA 复制具有高保真性
   1. 半保留复制
   2. 严格碱基配对
   3. 错配修复：原核生物 DNA 复制低错误率主要与 DNA pol Ⅰ 的 3’-5’ 外切酶活性（即时校对功能）有关。
   4. 复制叉的复杂结构：避免过早解旋导致碱基/单链DNA被修饰或水解

DNA 复制的酶学和拓扑学

原核生物和真核生物 DNA 聚合酶对比

原核生物 DNA 复制过程

1. 解松超螺旋：拓扑异构酶
   • 拓扑异构酶 Ⅰ：可以切断 DNA 双链中的 1 条单链，随后又可以封闭（形成 3’,5’-磷酸二酯键，结合连接 DNA 单链），不消耗 ATP
   • 拓扑异构酶 Ⅱ：可以切断 DNA 双链中的 2 条单链，随后又可以封闭，消耗 ATP
2. DnaA：辨认、结合起始点 oriC（E.coli 上固定起点，富含 AT）
3. 开链：
   • DnaB（解旋酶）：解开双链足够用于复制的长度，并且逐步置换出 DnaA
   • DnaC：协助 DnaB，将其运到起始部位
4. SSB（单链结合蛋白）和已经解开的 DNA 单链结合，稳定开链，保持复制叉的长度
5. 引物合成：DnaG（引物酶）
   • 引发体：引物酶进入后，DnaB、DnaC、DnaG 和复制起始点共同构成的起始复合体结构
   • 引物长度一般 5–10 个核苷酸
   • 利福平可以特异性的阻断 RNA 聚合酶，但是引物酶对其不敏感
6. 复制的延长：DNA pol Ⅲ
   • 前导链和后随链用的是同一个酶，故和真核生物有区别——没有酶的转换
   • 关键亚基：
     • ε 亚基：保真
     • 一对 β 亚基：夹住模版链，使酶沿模版滑动
   • 酶活性：5’-3’ 聚合、3’-5’ 外切（校对）
7. 水解引物：DNA pol Ⅰ 大片段（Klenow 片段）：5′-3′ 外切
8. 填补空隙：DNA pol Ⅰ 小片段：5′-3′ 聚合、3′-5′ 外切（校对）
9. 连接缺口：DNA 连接酶：
   • 消耗 ATP，连接缺口
   • 只能连接双链中的单链缺口，不能连接单独存在的 DNA 单链或 RNA 单链
   • 是基因工程重要的工具酶之一

真核生物 DNA 复制过程

1. 复制起始和原核生物基本类似，具体过程不详。
   • DNA pol α（引物）、δ（后随链）、ε（前导链） 参与复制起始
   • 特点
     • 每个染色体有上千个复制子，复制起点很多，复制起点较复杂
     • 复制有时序性，复制子以分组方式激活，而不是同步启动
   • 起点：酵母DNA复制起点含11bp富含AT的核心序列——自主复制序列(和原核生物相比有长有短)
   • DNA 聚合酶：
     • DNA pol α：引物酶
     • DNA pol β：真核生物 DNA 修复
     • DNA pol γ：真核生物线粒体 DNA 按 D-环方式复制
     • DNA pol δ：后随链
     • DNA pol ε：前导链
   • 解旋酶
   • 拓扑酶
   • 复制因子：RFA、RFC
   • PCNA（增殖细胞核抗原）：在复制的起始和延长（和中止）中起到重要的作用
     1. 起始：类似于 DNA pol Ⅲ 的 β 亚基，在 RFC 的作用下结合于引物-模板（固定）
     2. 延长：使 DNA pol δ 获得持续合成的能力（α-δ 转换）
     3. 中止：促进核小体生成
2. 延长过程中发生 DNA 聚合酶转换：α 和 δ 互相转换，转换频率高，催化速度慢（真核生物复制速度慢），PCNA 全程多次发挥作用，引物、冈崎片段均比原核生物要短
3. 真核生物 DNA 合成后立即组装成核小体

• 真核生物染色体DNA在每个细胞周期中只能复制一次
• 真核生物线粒体 DNA 按 D 环方式复制：mtDNA 为闭合环状双链结构
• 端粒酶解决染色体末端复制问题
  • 意义：维持染色体稳定，DNA 复制的完整性
  • 构成和功能：
    1. 端粒酶 RNA（hTR）：提供 RNA 模版
    2. 端粒酶逆转录酶（hTRT）：催化逆转录（RNA 指导的 DNA 聚合酶活性）
    3. 端粒酶协同蛋白 1（hTP1）
  • 过程：
    1. 端粒酶逆转录酶通过端粒自身的 RNA 模板，指导延长 DNA 母链
    2. 引物酶：RNA 引物酶通过新合成的母链，合成引物）
    3. 招募 DNA pol，以 DNA 母链为模板，沿着新合成的引物进行填充
    4. 水解 RNA 引物

逆转录

• 引物：逆转录的引物由病毒颗粒自身的 tRNA 提供。
• 逆转录酶活性：
  • RNA 指导的 DNA 聚合酶活性（RNA → DNA）：RNA 指导的 DNA 聚合
  • RNase H（Hybrid）活性：水解杂化双链中的 RNA 单链
  • DNA 指导的 DNA 聚合酶活性（DNA → DNA）：DNA 指导的 DNA 聚合（没有校对活性）“DNA 模板也可直接用于/参与逆转录”
• 逆转录的意义：
  • 遗传信息从 RNA 流动到 DNA
  • 发展了中心法则
  • 拓宽了病毒致癌理论，从逆转录病毒中发现了癌基因（HIV 也是 RNA 病毒，有逆转录活性）
  • 是获取目的基因重要的方法之一——cDNA 法

DNA 损伤

DNA 损伤的原因与DNA 损伤之间为复杂的多对多关系，掌握嘧啶二聚体即可：

• 原因：紫外照射（电离辐射）
• 损伤类型：DNA 链共价交联（碱基损伤）
• 修复方式：直接修复（DNA 光裂合酶-光修复）

• 损伤的类型：碱基损伤与糖基破坏，碱基之间发生错配，DNA 链发生断裂（电离辐射造成 DNA 损伤的主要形式），链内/链间/DNA-蛋白质，DNA 链的共价交联（嘧啶二聚体）
• 损伤的结果：可导致 DNA 模板发生碱基置换、插入、缺失、链的断裂等变化，并影响染色体的高级结构
• 碱基置换
  • 转换：嘌呤换嘌呤或者嘧啶换嘧啶
  • 颠换：嘌呤和嘧啶之间互换
  • 可引起碱基错配,导致基因突变
• 可能但是不一定引起氨基酸编码的改变(简并性)
  • 错义突变：改变氨基酸编码
  • 同义突变：不改变氨基酸编码
  • 无义突变：变为终止密码子
• 碱基插入和缺失：移码突变
• DNA 断裂：阻止 RNA 合成过程中链的延伸

DNA 损伤修复

1. 直接修复
   • 嘧啶二聚体的直接修复：DNA 光裂合酶-光修复
   • 烷基化碱基的直接修复：烷基转移酶
2. 切除修复：最普遍的 DNA 损伤修复方式
   1. 碱基切除修复：
      1. 识别水解：DNA 糖苷酶，识别受损碱基，去除后形成无碱基位点（AP 位点）
      2. 切除：无碱基位点核酸内切酶，切掉剩下的磷酸核糖
      3. 合成：DNA 聚合酶合成互补序列
      4. 连接：DNA 连接酶将切口重新连接
   2. 核苷酸切除修复：
      • 识别损伤对 DNA 双螺旋结构所造成的扭曲
      • 损伤部位两侧切开 DNA 链，去除切口间的寡核苷酸
      • DNA 聚合酶作用下，填补缺损
      • DNA 连接酶连接缺口
   3. 碱基错配修复：是碱基切除修复的一种特殊形式
3. 重组修复：双链断裂的修复形式
   • 同源重组修复
   • 非同源末端连接的重组修复
4. 跨越损伤 DNA 合成：应用于 DNA 双链发生大范围损伤时，跨越过损伤部位进行复制，随后再修复
   • 重组跨越损伤修复：拆东墙补西墙，损伤没有被真正的修复，转移到了另一个 DNA 分子上
   • 合成跨越损伤修复：
     • SOS 修复
       • DNA pol Ⅳ、Ⅴ
         • 活性低，识别碱基精确度差，无校对功能，故出错的概率较大
         • 产生新的聚合酶（DNA pol Ⅳ、Ⅴ）替代原来的 DNA 聚合酶 Ⅲ
         • 随机插入核苷酸进行合成
         • 跨越损伤后，新的 DNA 聚合酶从 DNA 链上脱离，再由原来的 DNA 聚合酶 Ⅲ 继续复制
       • DNA pol Ⅱ 也参与 SOS 修复，但需要校对

• DNA 损伤具有双重效应
  • 可造成 DNA 突变，突变是进化的分子基础
  • 可造成细胞功能障碍，甚至死亡
• DNA 损伤修复障碍与多种疾病相关 简单看看
  • 着色性干皮病：核苷酸切除修复
  • 遗传性非息肉性结肠癌：错配修复、转录偶联修复（DNA 修复调节基因）
  • 遗传性乳腺癌：同源重组修复
  • Bloom综合征：非同源末端连接重组修复
  • 范可尼贫血：重组跨越损伤修复
  • Cockyne综合征：核苷酸切除修复、转录偶联修复
  • 毛发低硫营养不良：核苷酸切除修复