DNA 重组和重组 DNA 技术

DNA 重组: 指 DNA 分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程。

同源重组（基本重组）
- 是指发生在两个相似或相同（同源）DNA 分子之间核苷酸序列互换的过程
- 是最基本的 DNA 重组方式，又称基本重组
位点特异性重组
- 是发生在特异位点间的 DNA 整合
- 是指发生在至少拥有一定程度序列同源性片段间DNA链的互换过程,也称保守的位点特异性重组
- 位点特异性重组酶(SSR)通过识别和结合DNA短序列(位点)使DNA片段发生重排
转座重组
- 是指由插入序列和转座子介导的基因移位或重排

体外通过人工 DNA 重组可获得重组体 DNA，是基因工程中的关键步骤。

原核细胞可通过接合、转化和转导进行基因转移或重组

接合作用：指细菌的遗传物质在细菌细胞间通过细胞-细胞直接接触或细胞间桥样连接的转移过程，如细菌通过鞭毛相互接触转移质粒 DNA。
转化作用：是处于敏化状态的受体细胞自主摄取外源 DNA 并与之整合的现象。
- 由于较大的外源 DNA 不易透过细胞膜，因此，自然界发生转化作用的效率并不高，染色体整合概率则更低。
转导作用：是病毒或病毒载体将供体 DNA 带入受体并与之染色体发生整合的现象。

重组 DNA 技术

重组 DNA 技术: 指通过体外操作将不同来源的两个或两个以上 DNA 分子重新组合，并在适当细胞中扩增形成新功能 DNA 分子的方法。

主要过程：

在体外将目的 DNA 片段与能自主复制的遗传元件（又称载体）连接，形成重组 DNA 分子，进而在受体细胞中复制、扩增及克隆化，从而获得单一 DNA 分子的大量拷贝
在克隆目的基因后，还可针对该基因进行表达产物蛋白质或多肽的制备以及基因结构的定向改造

重组 DNA 技术中常用的工具酶

对目的 DNA 进行处理时，需利用序列特异性限制性核酸内切酶（RE），RE 在准确的位置切割 DNA，使较大的 DNA 分子成为一定大小的 DNA 片段；构建重组 DNA 分子时，必须在 DNA 连接酶催化下才能使 DNA 片段与载体共价连接。

重组 DNA 技术中常用的工具酶

工具酶	功能
RE	识别特异序列,切割 DNA
DNA 连接酶	催化 DNA 中相邻的 5′-磷酸基团和 3′-羟基末端之间形成磷酸二酣键，使 DNA 切口封合或使两个 DNA 分子或片段连接起来
DNA 聚合酶 Ⅰ	具有 5′-3′ 聚合和 3′-5′、5′-3′ 外切活性，用于合成双链 cDNA 分子或片段连接；缺口平移法制作高比活性探针；DNA 序列分析；填补 3′ 末端
Klenow 片段	即 DNA 聚合酶 Ⅰ 大片段，具有完整 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 5′-3′ 聚合及 3′-5′ 外切活性，但缺乏 5′-3′ 外切活性。常用于 cDNA 第二链合成、双链 DNA 的 3′-端标记等
逆转录酶	是以 RNA 为模板的 DNA 聚合酶，用于合成 cDNA，也用于替代 DNA 聚合酶 Ⅰ 进行缺口填补、标记或 DNA 序列分析等
多聚核昔酸激酶	催化多聚核昔酸5′-胫基末端磷酸化或标记探针等
末端转移酶	在3′-羟基末端进行同质多聚物加尾
碱性磷酸酶	切除末端磷酸基团

限制性核酸内切酶

是最重要的工具酶，能识别双链 DNA 分子内部的特异序列并裂解磷酸二酯键
分类
- Ⅰ 型和 Ⅲ 型酶为复合功能酶：同时具有限制和 DNA 修饰两种作用，且不在所识别的位点切割 DNA（即特异性不强）
- Ⅱ 型：能在 DNA 双链内部的特异位点识别并切割，故其被广泛用作“分子剪刀”，对 DNA 进行精确切割
  - 重组 DNA 技术中所说的 RE 通常指 Ⅱ 型酶。
RE识别及切割特异DNA序列
- 大多数 RE 的识别序列为回文序列，回文结构是指在两条核苷酸链的特定位点，从 5′→3′ 方向的序列完全一致。
- 注意：这里的“回文”与一般所说的不同，AATT 是回文序列，而 ATA 不是。

另外几种酶的功能解释

碱性磷酸酶：预处理线性化载体 DNA，切除 DNA 末端磷酸基团，，避免自身环化。
多聚核苷酸激酶：与碱性磷酸酶相反，（需要使用时）在末端加上磷酸基团。
末端转移酶：造人工黏端。

重组 DNA 技术中常用的载体

载体: 为携带目的外源 DNA 片段、实现外源 DNA 在受体细胞中无性繁殖或表达蛋白质所采用的一些 DNA 分子。

克隆载体

克隆载体: 指用于外源 DNA 片段的克隆和在受体细胞中扩增的 DNA 分子。

基本特点
1. 至少有一个复制起点使载体能在宿主细胞中自主复制，并能使克隆的外源 DNA 片段得到同步扩增
2. 至少有一个选择标志，从而区分含有载体和不含有载体的细胞
3. 有适宜的 RE 单一切点（因为不需要表达），可供外源基因插入载体
常用克隆载体
1. 质粒克隆载体^最常用：质粒是细菌染色体外的、能自主复制和稳定遗传的双链环状 DNA 分子，具备作为克隆载体的基本特点。
2. 噬菌体 DNA 载体：λ 和 M13 噬菌体 DNA 常用作克隆载体。
3. 其他克隆载体：为增加克隆载体携带较长外源基因的能力，还设计有柯斯质粒载体（又称黏粒载体）、细菌人工染色体（BAC）载体（~~大肠杆菌 DNA~~）和酵母人工染色体（YAC）载体等。

表达载体

表达载体: 是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体。

原核表达载体：用于在原核细胞中表达外源基因，由克隆载体发展而来，除了具有克隆载体的基本特征外，还有供外源基因有效转录和翻译的原核表达调控序列。
真核表达载体：用于在真核细胞中表达外源基因，也是由克隆载体发展而来的，除了具备克隆载体的基本特征外，所提供给外源基因的表达元件是来自真核细胞的。
- 质粒真核表达载体的特点
  - 含有必不可少的原核序列
  - 真核表达调控元件
  - 真核细胞复制起始序列,用于载体或基因表达框架在真核细胞中的复制
  - 真核细胞药物抗性基因,用于载体在真核细胞中的阳性筛选
- 根据真核宿主细胞的不同，真核表达载体可分为酵母表达载体、昆虫表达载体和哺乳类细胞表达载体等

重组 DNA 技术的基本原理及操作步骤

分：目的 DNA 的分离获取

化学合成法
- 可直接合成目的DNA片段,通常用于小分子肽类基因的合成
- 前提是已知某基因的核苷酸序列,或能根据氨基酸序列推导出相应核苷酸序列
- 一般先合成两条完全互补的单链,经退火形成双链,然后克隆于载体
文库法：从基因组文库和cDNA文库中获取目的DNA
PCR法
- PCR 是一种高效特异的体外扩增 DNA 的方法
- 前提：已知待扩增目的基因或 DNA 片段两端的序列，并根据该序列合成适当引物
其他方法
- 采用酵母单杂交系统克隆 DNA 结合蛋白的编码基因
- 用酵母双杂交系统克隆特异性相互作用蛋白质的编码基因

选：载体的选择与准备

进行DNA克隆的目的
- 获取目的 DNA 片段：通常选用克隆载体
- 获取目的 DNA 片段所编码的蛋白质：需选择表达载体
选择载体时还要考虑目的 DNA 的大小、受体细胞的种类和来源等因素。
选择载体时还需要注意，载体内应有适宜的单一酶切位点（克隆载体）或 MCS（多克隆位点）（表达载体），以便根据目的 DNA 片段，对载体进行适当的酶切处理。

连：目的 DNA 与载体的连接

黏端连接

依靠酶切后的黏性末端进行连接，不仅连接效率高，也具有方向性和准确性。

单一相同黏端连接：如果目的 DNA 序列两端和线性化载体两端为同一 RE（或同切点酶，或同尾酶）切割所致，那么所产生的黏端完全相同。
- 连接结果：载体自连（载体自身环化）、载体与目的 DNA 连接和 DNA 片段自连
- 缺点：容易出现载体自身环化、目的DNA可以双向插入载体(即正向和反向插入)及多拷贝连接现象,从而给后续筛选增加了困难
- 采用碱性磷酸酶，预处理线性化载体 DNA，使之去磷酸化，可有效减少载体自身环化
- 目的 DNA 如果反向插入载体，虽然不影响基因克隆，但却影响外源基因的表达。
不同黏端连接：如果用两种不同的 RE 分别切割载体和目的 DNA，则可使载体和目的 DNA 的两端均形成两个不同的黏端，这样可以让外源 DNA 定向插入载体。
- 这种使目的基因按特定方向插入载体的克隆方法，称为定向克隆。
- 定向克隆也可通过一端为平端，另一端为黏端的连接方法来实现。
- 定向克隆可有效避免载体自连和 DNA 片段的反向插入和多拷贝现象。
通过其他措施产生黏端的连接：在末端为平端的目的 DNA 片段制造黏端。
1. 人工接头法：
  - 用化学合成法获得含 RE 位点的平端双链寡核苷酸接头，将此接头连接在目的 DNA 的平端上，然后用相同的 RE 切割人工接头产生黏端，进而连接到载体上。
2. 加同聚物尾法：
  - 用末端转移酶将某一核苷酸逐一加到目的DNA的3′-端羟基上,形成同聚物尾
  - 同时又将与之互补的另一核苷酸加到载体DNA的3′-端羟基上,形成与目的DNA末端互补的同聚物尾
  - 两个互补的同聚物尾均为黏端,因而可高效率地连接到一起
3. PCR 法：针对目的 DNA 的 5′-端和 3′-端设计一对特异引物，在每条引物的 5′-端分别加上不同的 RE 位点，然后以目的 DNA 为模板，经 PCR 扩增便可得到带有引物序列的目的 DNA，再用相应 RE 切割 PCR 产物，产生黏端，随后便可与带有相同黏端的线性化载体进行有效连接。

平端连接

若目的 DNA 两端和线性化载体两端均为平端，则两者之间也可在 DNA 连接酶的作用下进行连接。

连接结果：载体自连、载体与目的DNA连接和DNA片段自连
连接效率都较低,为了提高连接效率,可采用提高连接酶用量、延长连接时间、降低反应温度、增加DNA片段与载体的摩尔比等措施
与黏端连接一样，平端连接同样存在载体自身环化、目的 DNA 双向插入和多拷贝现象等缺点。

黏-平端连接

是指目的 DNA 和载体通过一端为黏端、另一端为平端的方式进行连接
目的 DNA 被定向插入载体（定向克隆），连接效率介于黏端和平端连接之间
可采用提高平端连接效率的措施提高该方式的连接效率

转：重组 DNA 转入受体细胞

重组 DNA 转入宿主细胞后才能得到扩增，理想的宿主细胞通常是 DNA/蛋白质降解系统和（或）重组酶缺陷株，这样的宿主细胞称为工程细胞。工程细胞具有较强的接纳外源 DNA 的能力，可保证外源 DNA 长期、稳定地遗传或表达。

转化（导入对象）
- 是指将外源 DNA 直接导入细菌、真菌的过程。
- 包括化学诱导法、电穿孔法等
- 将质粒 DNA 直接导入酵母细胞，以及将黏粒 DNA 导入细菌的过程，也称作转化。
转染（导入对象）：
- 是指将外源 DNA 直接导入真核细胞（酵母除外）的过程。
- 常用的转染方法包括化学方法（如磷酸钙共沉淀法、脂质体融合法等）和物理方法（如显微注射法、电穿孔法等）
- 噬菌体 DNA → 细菌：将噬菌体 DNA 直接导入受体细菌的过程，也称作转染。
感染（导入载体）：
- 是指以病毒颗粒作为外源 DNA 运载体导入宿主细胞的过程。
- 例如，以噬菌体、逆转录病毒、腺病毒等 DNA 作为载体构建的重组 DNA 分子，经包装形成病毒颗粒后进入宿主细胞。

筛：重组体的筛选及鉴定

重组DNA分子导入宿主细胞后,可通过载体携带的选择标记或目的DNA片段的序列特征进行筛选和鉴定,从而获得含重组DNA分子的宿主细胞。

借助载体上的遗传标志进行筛选
1. 抗生素抗性标志筛选：
  - 将含有某种抗生素抗性基因的重组载体转化宿主细胞，然后在含相应抗生素的培养液中培养此细胞
  - 若细胞能在这种条件下生长，则说明细胞中至少应含有导入的载体，但是否是插入目的 DNA 的载体，还需要进一步鉴定
  - 若细胞中没有载体，则被抗生素杀死
2. 基因的插入失活/插入表达特性筛选：
  - 针对某些带有抗生素抗性基因的载体，当目的 DNA 插入抗性基因后，可使该抗性基因失活
  - 如果还以这种抗生素抗性进行筛选，不能生长的细胞应该是含重组 DNA 的细胞。以这种方式筛选时，通常载体上携带一个以上筛选标志基因
3. 标志补救筛选：
  - 是指当载体上的标志基因在宿主细胞中表达时,宿主细胞通过与标志基因表达产物互补弥补自身的相应缺陷,从而在相应选择培养基中存活
  - 利用该策略可初步筛选含有载体的宿主细胞
  - 标志补救也可用于外源基因导入哺乳类细胞后阳性克隆的初筛
  - 利用 α 互补筛选携带重组质粒的细菌也是一种标志补救筛选方法
4. 利用噬菌体的包装特性进行筛选（长度合适）：只有长度足够的 DNA 才能包装，故如果没有外源性 DNA 的重组，则长度不够无法包装。
序列特异性筛选
1. RE 酶切法：针对初筛为阳性的克隆，提取其重组 DNA，以合适的 RE 进行酶切消化，经琼脂糖凝胶电泳便可判断有无目的 DNA 片段的插入及插入片段的大小。
2. PCR 法
  - 利用序列特异性引物，经 PCR 扩增，可鉴定出含有目的 DNA 的阳性克隆
  - 如果利用克隆位点两侧载体序列设计引物进行 PCR 扩增，再结合序列分析，便能可靠地证实插入片段的方向、序列和可读框的正确性
3. 核酸杂交法：可直接筛选和鉴定含有目的 DNA 的克隆
4. DNA 测序法：是最准确的鉴定目的 DNA 的方法。
亲和筛选法
- 前提是重组 DNA 进入宿主细胞后能够表达出其编码产物
- 常用的亲和筛选法的原理是基于抗原-抗体反应或配体-受体反应

表：克隆基因的表达

在蛋白质表达领域,表达体系的建立包括表达载体的构建、宿主细胞的建立及表达产物的分离、纯化等技术和策略

原核表达体系：培养方法简单、迅速、经济而又适合大规模生产工艺
- 原核表达载体的必备条件
  - 含 E.coli 适宜的选择标志
  - 具有能调控转录、产生大量mRNA的强启动子
  - 含适当的翻译控制序列
  - 含有合理设计的MCS,以确保目的基因按一定方向与载体正确连接
- 重组蛋白质的表达策略：略
- E.coli 表达体系的缺点
  - 缺乏转录后加工机制,对于真核基因来说 E.coli 表达体系只能表达经逆转录合成的cDNA编码产物,不宜表达从基因组DNA上扩增的基因
  - 由于缺乏适当的翻译后加工机制,真核基因的表达产物在 E.coli 表达体系中往往不能被正确的折叠或糖基化修饰
  - 表达的蛋白质常常形成不溶性包含体,欲使其具有活性尚需进行复杂的变性-复性处理
  - 很难用 E.coli 表达体系表达大量的可溶性蛋白质
真核表达体系：真核表达载体通常含有供真核细胞用的选择标记、启动子、转录和翻译终止信号、mRNA 的 poly（A）加尾信号或染色体整合位点等。真核表达体系有酵母、昆虫、哺乳类细胞等，不仅可以表达克隆的 cDNA，也可表达从真核基因组 DNA 扩增的基因。
- 优势
  - 具有转录后加工机制
  - 具有翻译后修饰机制
  - 表达的蛋白质不形成包含体(酵母除外)
  - 表达的蛋白质不易被降解
- 缺点
  - 操作技术难、费时、费钱

重组 DNA 技术在医学中的应用

重组 DNA 技术广泛应用于生物制药
- 可用于改造传统的制药工业
- 利用该技术生产有药用价值的蛋白质/多肽及疫苗抗原等产品
- 利用重组 DNA 技术，可以让细菌、酵母等低等生物成为制药工厂，也使基因工程细菌成为各类生物基因的储藏所
- 可以将小鼠杂交瘤细胞人源化，让其产生人源化抗体
- 可以制造基因工程病毒，使病毒保留免疫原性，缺乏感染性或变成不含核酸的类病毒颗粒
重组 DNA 技术是医学研究的重要技术平台
- 遗传修饰动物模型的医用研究
- 遗传修饰细胞模型在医学研究中的应用
- 基因及基因功能的获得及丧失的研究
重组 DNA 技术是基因及其表达产物研究的技术基础
- 在基因组水平上干预基因
- 在RNA水平上干预基因的功能
- 研究蛋白质的相互作用