蛋白质合成体系

mRNA：蛋白质合成的模板

• 由 DNA 转录而来的 mRNA 在细胞质内作为蛋白质合成的模板，mRNA 编码区（可读框）中的核苷酸序列作为遗传密码，在蛋白质合成过程中被翻译为蛋白质的氨基酸序列
• mRNA 分子中核苷酸序列的翻译以 3 个相邻核苷酸为单位进行。在 mRNA 的可读框区域，每 3 个相邻的核苷酸为一组，编码一种氨基酸或肽链合成的起始/终止信息，称为密码子，又称三联体密码
• 构成 mRNA 的 4 种核苷酸经排列组合可产生 64 个密码子，其中的 61 个编码 20 种在蛋白质合成中作为原料的氨基酸，另有 3 个（UAA、UAG、UGA）不编码任何氨基酸，而是作为肽链合成的终止密码子
• AUG具有特殊性，不仅代表甲硫氨酸，如果位于 mRNA 的翻译起始部位，它还代表肽链合成的起始密码子（色氨酸也只有一个密码子 UGG，在终止密码子的右下角）

1. 方向性：
   • 翻译时的阅读方向只能从 5’至 3’，即从 mRNA 的起始密码子 AUG 开始，按 5’→3’的方向逐一阅读，直至终止密码子
2. 连续性：
   • mRNA 中密码子之间没有间隔核苷酸，即从起始密码子开始，密码子被连续阅读，直至终止密码子出现
   • 若可读框中插入或缺失了非 3 的倍数的核苷酸，将会引起 mRNA 可读框发生移动，称为移码
   • 移码导致后续氨基酸编码序列改变，使得其编码的蛋白质彻底丧失或改变原有功能，称为移码突变
   • 若连续插入或缺失 3 个核苷酸，则只会在多肽链产物中增加或缺失 1 个氨基酸残基，但不会导致可读框移位
3. 简并性：
   • 64 个密码子中有 61 个编码氨基酸，而氨基酸只有 20 种，因此有的氨基酸可由多个密码子编码，这种现象称为简并性
   • 为同一种氨基酸编码的各密码子称为简并性密码子，也称同义密码子
   • 同义密码子的前两位碱基相同，仅第三位碱基有差异，即密码子的特异性主要由前两位核苷酸决定，意味着密码子第三位核苷酸的改变往往不改变其编码的氨基酸，合成的蛋白质具有相同的一级结构
   • 遗传密码的简并性可减少基因突变所带来的生物学效应
4. 摆动性
   • tRNA 的反密码子的第 1 位碱基与 mRNA 密码子的第 3 位碱基配对，有时并不严格遵循 Watson-Crick 碱基配对原则，出现摆动
   • I 不和 G 配 我（I）和她（Girl）不配：反密码子第 1 位碱基为次黄嘌呤（I），可与密码子第 3 位的 A、C、U 配对
   • U 和 G 配 你（U）和她（Girl）配：
     • 反密码子第 1 位的 U，可与密码子第 3 位的 A、G 配对
     • 反密码子第 1 位的 G，可与密码子第 3 位的 C、U 配对
5. 通用性
   • 即从低等生物如细菌到人类都使用着同一套遗传密码

tRNA：氨基酸和密码子之间的特异连接物

$$\ce{氨基酸 + \rm{tRNA} + ATP ->[氨酰-tRNA 合成酶][Mg2+] 氨酰-\rm{tRNA} + AMP + PPi}
\,.$$

• 功能：
  • 作为蛋白质合成原料的 20 种氨基酸，翻译时由其各自特定的 tRNA 负责转运至核糖体
  • 一种氨基酸通常与多种 tRNA 特异结合（与密码子的简并性相适应），但是一种 tRNA 只能转运一种特定的氨基酸
• tRNA 上重要的功能部位
  • 氨基酸结合部位：tRNA 的氨基酸臂的-CCA 末端的腺苷酸 3’-OH，与氨基酸以酯键相连
  • mRNA 结合部位：tRNA 反密码环中的反密码子
• 氨酰-tRNA 合成酶：
  • 对底物 tRNA 和氨基酸均有高度特异性，决定氨基酸与 tRNA 的特异性结合
  • 校对活性：能将错误结合的氨基酸水解释放
• 耗能：每个氨基酸活化成氨酰-tRNA 时消耗 2 ATP（1 ATP，2 高能磷酸键）

核糖体：蛋白质的合成场所

• 合成肽链时mRNA与tRNA的相互识别、肽键形成、肽链延长等过程全部在核糖体上完成
• 核糖体类似于一个移动的多肽链"装配厂”,沿着模板mRNA链从5’端向3’端移动
• 携带着各种氨基酸的tRNA分子依据密码子与反密码子配对关系,快速进出其中为延长肽链提供氨基酸原料
• 肽链合成完毕,核糖体立刻离开mRNA分子
• 原核生物和真核生物的核糖体上均存在A位、P位和E位这3个重要的功能部位
  • A位（氨酰位）：结合氨酰-tRNA
  • P位（肽酰位）：结合肽酰-tRNA
  • E位（排出位）：释放已经卸载了氨基酸的tRNA

蛋白质合成需要多种酶类和蛋白质因子

• 蛋白质合成需要由 ATP 或 GTP 供能，需要 Mg2+、肽酰转移酶、氨酰-tRNA 合成酶等多种分子参与反应
• 起始、延长及终止各阶段还需要多种因子参与
  • 起始因子（IF），原核生物和真核生物的起始因子分别以 IF 和 eIF 表示
  • 延长因子（EF），原核生物与真核生物的延长因子分别以 EF 和 eEF 表示
  • 终止因子，又称释放因子（RF），原核生物与真核生物的释放因子分别以 RF 和 eRF 表示
• 真核生物肽链合成所需要的蛋白质因子（9 版生物化学 P290 表 15-3，不做要求）

肽链的合成过程

翻译起始复合物的形成

原核生物翻译起始复合物的形成

1. 核糖体大小亚基分离：
   • 完整核糖体在 IF 的帮助下，大、小亚基解离
   • IF3 的作用是稳定大、小亚基的分离状态，避免大小亚基过早结合IF3
2. mRNA 与核糖体小亚基结合
   • 小亚基与 mRNA 结合时，可准确识别可读框的起始密码子 AUG，而不会结合内部的 AUG，从而正确地翻译出所编码蛋白质
   • mRNA 起始密码子 AUG 上游，存在一段被称为核糖体结合位点（RBS）的序列，该序列距 AUG 上游约 10 个核苷酸处通常为 -AGGAGG-（S-D 序列），可被 16S rRNA 通过碱基互补而精确识别，从而将核糖体小亚基准确定位于 mRNAS-D 序列
3. fMet-tRNA^fMet 结合在核糖体 P 位（A 位）
   • fMet-tRNA^fMet 与结合了 GTP 的 IF2 一起，识别并结合对应于小亚基 P 位的 AUG 处IF2
   • 此时，A 位被 IF1 占据，不与任何氨酰-tRNA 结合IF1
4. 翻译起始复合物形成：
   • 结合于 IF2 的 GTP 被水解（IF2 有 GTPase 活性），释放的能量促使 3 种 IF 释放。
   • 大亚基与结合了 mRNA、fMet-tRNA fMet 的小亚基结合，形成由完整核糖体（大小亚基）、mRNA、fMet-tRNA^fMet 组成的翻译起始复合物。

真核生物翻译起始复合物的形成

不要求掌握，了解以下概括即可：

1. 起始因子种类更多，过程更复杂
2. 5’ 帽和 3’ 尾均为正确起始所必需
3. 氨酰-tRNA 先于 mRNA 结合于小亚基，与原核生物装配顺序不同

肽链延长

1. 进位（注册）：氨酰-tRNA 在 EF-Tu 等的帮助下，按照 mRNA 模板的指令进入核糖体 A 位：
   • 翻译起始复合物中的 A 位是空闲的，并对应着可读框的第二个密码子，进入 A 位的氨酰-tRNA 种类即由该密码子决定
   • 氨酰-tRNA 先与 GTP-EF-Tu 结合成一复合物，然后进入 A 位，GTP 随之水解，EF-Tu-GDP 从核糖体释放。GTP-EF-Tu 又可循环生成
   • 核糖体对氨酰-tRNA 的进位有校正作用：只有正确的氨酰-tRNA 能迅速发生反密码子-密码子互补配对而进入 A 位。错误的氨酰-tRNA 因反密码子-密码子不能配对结合而从 A 位解离。
2. 成肽：指核糖体 A 位和 P 位上的 tRNA 所携带的氨基酸缩合成肽的过程
   • 肽酰转移酶：该酶的化学本质不是蛋白质，而是 RNA（核酶），在原核生物为 23S rRNA，在真核生物为 28S rRNA。
   • 在起始复合物中，P 位上起始 tRNA 所携带的甲酰甲硫氨酸，与 A 位上新进位的氨酰 tRNA 的α-氨基缩合形成二肽
   • 第一个肽键形成后，二肽酰-tRNA 占据核糖体 A 位，而卸载了氨基酸的 tRNA 仍在 P 位
3. 转位：成肽反应后，核糖体需要向 mRNA 的 3’-端移动一个密码子的距离，方可阅读下一个密码子
   • 核糖体的转位需要延长因子 EF-G（转位酶），并需要 GTP 水解供能
   • 转位作用：
     1. 卸载：P 位上的 tRNA 所携带的氨基酸或肽在成肽后交给 A 位上的氨基酸
     2. 释放：P 位上卸载的 tRNA 转位后进入 E 位，然后从核糖体脱落
     3. 移位：成肽后 A 位的肽酰-tRNA 移动到 P 位，A 位空出，且准确定位在 mRNA 的下一个密码子，以接受下一个氨酰-tRNA 进位

• 所需延长因子不同
  • 真核：eEF1α、eEF1βγ、eEF2
  • 原核：EF-Tu、EF-Ts、EF-G
• 在真核生物，一个新的氨酰-tRNA 进人 A 位后会产生别构效应，致使空载 tRNA 从 E 位排出

• 在蛋白质合成过程中，每生成 1 个肽键，至少需消耗 4 个高能磷酸键：

• 在肽链延长阶段，每生成一个肽键，都需要水解 2 分子 GTP（进位与转位各 1 分子）

• 氨基酸活化为氨酰-tRNA 时需消耗 2 个高能磷酸键（ATP）

• 其他：

  • 若出现不正确氨基酸进入肽链，也需要消耗能量来水解清除
  • 转录起始和中止也至少各需要 1 分子 GTP

终止密码子和释放因子导致肽链合成终止

终止密码子不被任何氨酰-tRNA 识别，只有释放因子 RF 能识别终止密码子而进人 A 位，这一识别过程需要水解 GTP。

• RF 的结合可触发核糖体构象改变，将肽酰转移酶转变为酯酶，水解 P 位上肽酰-tRNA 中肽链与 tRNA 之间的酯键，新生肽链随之释放，mRNA、tRNA 及 RF 从核糖体脱离，核糖体大小亚基分离。
• 原核生物有 3 种 RF：
  1. RF1：特异识别 UAA 或 UAG（1 是一竖））
  2. RF2：特异识别 UAA 或 UGA
     • RF1、RF2均可诱导肽酰转移酶转变为酯酶
  3. RF3：具有 GTPase 活性，当新生肽链从核糖体释放后，促进 RF1 或 RF2 与核糖体分离
• 真核生物仅有一种释放因子 eRF，3 种终止密码子均可被其识别

蛋白质合成后的加工

新生肽链折叠需要分子伴侣

蛋白质在合成时，尚未折叠的肽段有许多疏水基团暴露在外，具有分子内或分子间聚集的倾向，使蛋白质不能形成正确空间构象。

细胞中大多数天然蛋白质折叠并不是自发完成的，其折叠过程需要其他酶或蛋白质的辅助，这些辅助性蛋白质可以指导新生肽链按特定方式正确折叠，它们被称为分子伴侣。

1. 热激蛋白 70（Hsp 70）家族:
   • 高温刺激可诱导其合成
   • 在蛋白质翻译后加工过程中，Hsp70 与未折叠蛋白质的疏水区结合，既可避免蛋白质因高温而变性，又可防止新生肽链过早折叠
   • Hsp70 也可以使一些跨膜蛋白质在转位至膜前保持非折叠状态
   • 有些 Hsp70 通过与多肽链结合、释放的循环过程，使多肽链发生正确折叠。这个过程需要 ATP 水解供能，并需要其他伴侣蛋白如 Hsp40 的共同作用
   • 未折叠多肽链与 HsP70 结合，还可以解开多肽链之间的聚集或防止新聚集的产生
   • 人热激蛋白家族可存在于细胞质、内质网腔、线粒体、细胞核等部位，发挥细胞保护功能
     • 使线粒体和内质网蛋白质以未折叠状态转运和跨膜
     • 避免蛋白质变性后因疏水基团暴露而发生不可逆聚集
     • 清除变性或错误折叠的肽链中间物等
2. 有些肽链的正确折叠还需要伴侣蛋白发挥辅助作用。
   • 伴侣蛋白的主要作用是为非自发性折叠肽链提供正确折叠的微环境
3. 除了需要分子伴侣协助肽链折叠外，一些蛋白质形成正确空间构象还需要异构酶的参与
   • 蛋白质二硫键异构酶：帮助肽链内或肽链间二硫键的正确形成
   • 肽脯氨酰基顺-反异构酶：可使肽链在各脯氨酸残基弯折处形成正确折叠

肽链水解加工产生具有活性的蛋白质或多肽

• 新生肽链的水解是肽链加工的重要形式
• 新生肽链 N-端的甲硫氨酸残基，在肽链离开核糖体后，大部分即由特异的蛋白水解酶切除
  • 原核细胞：
    • 约半数成熟蛋白质的 N-端，经脱甲酰基酶，切除 N-甲酰基而保留甲硫氨酸
    • 另一部分被氨基肽酶水解，而去除 N-甲酰甲硫氨酸
  • 真核细胞：
    • 分泌蛋白质和跨膜蛋白质的前体分子的 N-端都含有信号肽序列，在蛋白质成熟过程中需要被切除
    • 有些情况下，C-端的氨基酸残基也需要被酶切除，从而使蛋白质呈现特定功能
• 许多蛋白质在初合成时，是分子量较大的没有活性的前体分子，这些前体分子也需经过水解作用切除部分肽段，才能成为有活性的蛋白质分子或功能肽
• 有些多肽链经水解可以产生数种小分子活性肽

氨基酸残基的化学修饰改变蛋白质的活性

• 化学修饰可改变蛋白质的溶解度、稳定性、亚细胞定位以及与细胞中其他蛋白质的相互作用等,从而使蛋白质的功能具有多样性
• 常见的蛋白质化学修饰：磷酸化、N-糖基化、O-糖基化、羟基化、甲基化、乙酰化、硒化（教材错误，半胱氨酸硒化应为翻译前的修饰）
  • 磷酸化：丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸
  • 羟基化：脯氨酸、赖氨酸
• 上述化学修饰均为酶促反应，蛋白激酶、糖基转移酶、羟化酶、甲基转移酶等都在这一过程中发挥重要作用

亚基聚合形成具有四级结构的活性蛋白质

• 许多具有特定功能的蛋白质由 2 条以上肽链构成，各肽链之间通过非共价键或二硫键维持一定空间构象
• 有些还需与辅基聚合才能形成具有活性的蛋白质

蛋白质合成的干扰和抑制

许多抗生素通过抑制蛋白质合成发挥作用

1. 抑制肽链合成起始的抗生素
   • 伊短菌素和密旋霉素可引起 mRNA 在核糖体上错位，从而阻碍翻译起始复合物的形成，对原核生物和真核生物的蛋白质合成均有抑制作用
   • 伊短菌素还可以影响起始氨酰-tRNA的就位和IF3的功能
   • 晚霉素结合于原核23S rRNA,阻止fMet-tRNA fMet的转位
2. 抑制肽链延长的抗生素
   1. 干扰进位的抗生素
      • 四环素：特异性结合30S亚基的A位,从而抑制氨酰-tRNA的进位
      • 粉霉素：可降低EF-Tu的GTP酶活性,从而抑制EF-Tu与氨酰-tRNA结合
      • 黄霉素：可阻止EF-Tu从核糖体释出
   2. 引起读码错误的抗生素
      • 氨基糖苷类抗生素能与30S亚基结合,影响翻译的准确性
      • 链霉素：与30S亚基结合,在较低浓度时引起读码错误(在高浓度时是抑制蛋白质合成的起始)
      • 潮霉素B和新霉素：能与16S rRNA及rpS12结合,干扰30S亚基的解码部位,引起读码错误
      • 这些抗生素均能使延长中的肽链引入错误的氨基酸残基,从而改变细菌蛋白质合成的忠实性
        3.影响成肽的抗生素
      • 氯霉素：结合核糖体50S亚基,通过阻止肽酰转移而抑制肽键形成
      • 林可霉素：作用于A位和P位,阻止tRNA在这两个位置就位,而抑制肽键形成
      • 红霉素(大环内酯类)：能与核糖体50S亚基中肽链排出通道结合,阻止新生肽链从核糖体大亚基中排出,从而阻止肽键的进一步形成
      • 嘌呤霉素：结构与酪氨酰-tRNA相似,在翻译中可取代酪氨酰-tRNA而进入核糖体A位,中断肽链合成
      • 放线菌酮：特异性抑制真核生物核糖体肽酰转移酶的活性
        4.影响转位的抗生素
      • 夫西地酸、硫链丝菌肽、微球菌素：抑制EF-G的转位酶活性,从而阻止核糖体转位
      • 大观霉素：结合核糖体30S亚基,阻碍小亚基变构,抑制转位反应

某些毒素抑制真核生物的蛋白质合成

• 白喉毒素 白糖嗅（修）盐（延）：真核细胞蛋白质合成的抑制剂，它作为一种修饰酶，可使 eEF2 发生 ADP-核糖基化修饰，生成 eEF2-腺苷二磷酸核糖衍生物，使 eEF2 失活，从而抑制蛋白质的合成
• 蓖麻毒蛋白
  • A 链是一种蛋白酶，可作用于真核生物核糖体大亚基的 28S rRNA，特异催化其中一个腺苷酸发生脱嘌呤反应，导致 28S rRNA 降解而使核糖体大亚基失活
  • B 链对 A 链发挥毒性起重要的促进作用
  • B 链上的半乳糖结合位点，也是蓖麻毒蛋白发挥毒性作用的活性部位