分子杂交和印迹技术

• 分子杂交和印迹技术的原理
  • 印迹技术
    • 将载有DNA单链分子的NC膜放在核酸杂交反应溶液中,溶液中具有互补序列的DNA或RNA单链分子就可以结合到存在于NC膜上的DNA分子上。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹,因此称之为“blotting”,译为印迹技术
    • 目前这种技术已广泛用于DNA、RNA和蛋白质的检测
  • 探针技术
    • 探针指的是带有放射性核素、生物素或荧光物质等可检测标志物的核酸片段,它具有特定的序列,能够与待测的核酸片段依据碱基互补原理结合,因此可以用于检测核酸样品中存在的特定核酸分子
    • 核酸探针既可以是人工合成的寡核苷酸片段,也可以是基因组DNA片段、cDNA全长或片段,还可以是RNA片段
    • 在 NC 膜杂交反应中，标记探针的序列如果与 NC 膜上的核酸存在碱基序列互补，就可以结合到膜上的相应 DNA 或 RNA 区带，经放射自显影或其他检测手段就可以判定膜上是否有互补序列的核酸分子存在
• 印迹技术的类别及应用
  1. DNA 印迹（Southernblotting）：主要用于基因组 DNA 的定性和定量分析
  2. RNA 印迹（Northernblotting）：主要用于检测特定组织或细胞中已知的特异 mRNA 和非编码 RNA 的表达水平，也可以比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况
  3. 蛋白质印迹（Westernblotting）：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等

PCR 技术的原理与应用

• PCR技术的工作原理

  • 在体外模拟体内DNA复制的过程
    • 以待扩增的DNA分子为模板,用两条寡核苷酸片段作为引物,分别在拟扩增片段的DNA两侧与模板DNA链互补结合,提供3’-0H末端
    • 在DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成两条新链的合成
    • 不断重复这一过程,即可使目的DNA片段得到扩增
  • PCR反应的特异性依赖于与模板DNA两端互补的寡核苷酸引物
  • 组成 PCR 反应体系的基本成分包括模板 DNA、特异 DNA 引物、耐热性 DNA 聚合酶、dNTP 以及含有 Mg2+的缓冲液
  • 基本反应步骤
    1. 变性：将反应体系加热至95°C,使模板DNA完全变性成为单链,同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除
    2. 退火：将温度下降至适宜温度（一般较 Tm 低 5°C），使引物与模板 DNA 结合
    3. 延伸：将温度升至 72°C，DNA 聚合酶以 dNTP 为底物催化 DNA 的合成反应

• PCR 技术的主要用途

  1. 获得目的基因片段
  2. DNA 和 RNA 的微量分析
  3. DNA 序列分析：是实现高通量 DNA 序列分析的基础
  4. 基因突变分析：可大大提高基因突变检测的敏感性
  5. 基因的体外突变：通过设计不同引物实现

• PCR衍生技术

  • 逆转录 PCR 技术（RT-PCR）：以 RNA 为模板，在逆转录酶作用下合成 cDNA，再以 cDNA 为模板通过 PCR 反应来扩增获取目的基因
    • RT-PCR 可检测到单个细胞中少于 10 个拷贝的特异 RNA，是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的 RNA 进行定性和半定量分析最有效的方法
  • 原位PCR技术：利用完整的细胞作为一个微小反应体系来扩增细胞内目的基因片段
  • 实时 PCR 技术：可以定量分析反应过程中产物量（研究基因表达），消除了产物堆积对定量分析的干扰，故亦被称为定量 PCR。

DNA 测序技术

• 目的是确定一段 DNA 分子中 4 种碱基（A、G、C、T）的排列顺序
• 方法：双脱氧法、化学降解法
• 医学用途
  • 通过人群大样本分析,确定单基因遗传病和多基因变异相关疾病的SNP位点、基因结构变异、基因拷贝数变异等,鉴定出可用于复杂性疾病易感性预警或早期诊断的疾病标志物,并将这些单一基因或多个基因的变异检测用于临床诊断。这些变异的发现还将指导治疗靶点的确认和药物研发
  • 检测肿瘤组织的染色体畸变、癌基因和抑癌基因突变位点、融合基因、染色体拷贝数变化等,为肿瘤分子分型和治疗敏感性监测提供依据
  • 进行个人基因组分析,在大数据平台发展的基础上,建立个人SNP位点与疾病易感性、药物敏感性和耐受性以及其他诸多表型之间的联系
  • 用于病原微生物检测,确定病原微生物的分子分型,为抗病毒或细菌感染治疗提供依据

生物芯片技术

基因芯片

• 是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上,然后与待测的荧光标记样品进行杂交,杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描,通过计算机系统对每一位点的荧光信号作出检测、比较和分析,从而迅速得出定性和定量的结果
• 基因芯片特别适用于分析不同组织细胞或同一细胞不同状态下的基因差异表达情况

蛋白质芯片

• 是将高度密集排列的蛋白质分子作为探针点阵固定在固相支持物上,当与待测蛋白质样品反应时,可捕获样品中的靶蛋白质,再经检测系统对靶蛋白质进行定性和定量分析的一种技术
• 基本原理是蛋白质分子间的亲和反应
• 具有快速和高通量等特点,它可以对整个基因组水平的上千种蛋白质同时进行分析,是蛋白质组学研究的重要手段之一,已广泛应用于蛋白质表达谱、蛋白质功能、蛋白质间的相互作用的研究

蛋白质的分离、纯化与结构分析

蛋白质沉淀用于蛋白质浓缩及分离

• 有机溶剂沉淀蛋白质：丙酮、乙醇等有机溶剂可以使蛋白质沉淀
• 盐析分离蛋白质：
  • 盐析是将硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。
  • 各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及 pH（蛋白质在等电点时，净电荷为零，稳定性最小）均不同，可据此将不同的蛋白质予以分离。
  • 血清中的清蛋白和球蛋白，前者可溶于 pH 7.0 左右的半饱和硫酸铵溶液中，而后者在此溶液中则发生沉淀。当硫酸铵溶液达到饱和时，清蛋白也随之析出
  • 盐析法可将蛋白质初步分离，但欲得纯品，尚需用其他方法
• 免疫沉淀分离蛋白质：利用抗原-抗体反应原理，特异性最高，可用于特定蛋白质定性和定量分析

透析和超滤法去除蛋白质溶液中的小分子化合物

• 利用透析袋将大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法称为透析
• 将蛋白质溶液装在透析袋内,置于水中,小分子物质可透过薄膜进入水溶液,由此可对盐析浓缩后的蛋白质溶液进行除盐
• 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜,达到浓缩蛋白质溶液的目的,称为超滤法

电泳分离蛋白质

电泳

通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术称为电泳。

• 纤维薄膜电泳
  • 将蛋白质溶液点样于薄膜上,薄膜两端分别加正、负电极
  • 带正电荷的蛋白质向负极泳动；带负电荷的蛋白质向正极泳动
  • 带电多，分子量小的蛋白质泳动速率快；带电少，分子量大的则泳动慢。
• 凝胶电泳
  • 凝胶置于玻璃板上或玻璃管中，凝胶两端分别加上正、负电极，蛋白质混合液即在凝胶中泳动
  • 电泳结束后，用蛋白质显色剂显色，即可看到多条已被分离的蛋白质色带

1. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：若蛋白质样品和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入带负电荷较多的十二烷基硫酸钠（SDS），使所有蛋白质颗粒表面覆盖一层 SDS 分子，掩盖蛋白质原有电荷的影响，此时蛋白质在电场中的泳动速率仅与蛋白质颗粒大小有关。
2. 等点聚焦电泳（IEE）：在聚丙烯酰胺凝胶中加入系列两性电解质载体，在电场中可形成一个连续而稳定的线性 pH 梯度（从凝胶的正极向负极依次递增），可使被分离的蛋白质处在偏离其等电点的 pH 位置时带有电荷而移动，当蛋白质泳动至与其自身的 pI 值相等的 pH 区域时，其净电荷为零而不再移动。
3. 双向凝胶电泳：第一向是蛋白质的 IEE，第二向为 SDS-PAGE，利用被分离蛋白质等电点和分子量的差异，将复杂蛋白质混合物在二维平面上分离

层析分离蛋白质

层析

待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的（相分配原理）。

• 阴离子交换层析：
  • 装柱：将阴离子交换树脂颗粒填充在层析管内，由于阴离子交换树脂颗粒上带正电荷，能吸引溶液中的阴离子
  • 吸附：再用含阴离子的溶液洗柱，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来（不是分离带/不带电荷，而是分离带电荷的量）
  • 洗脱：增加 Cl^- 浓度，含负电量多的蛋白质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开
• 凝胶过滤/分子筛层析：
  • 层析柱内填满带有小孔的颗粒，蛋白质溶液加于柱之顶部，任其往下渗漏，小分子蛋白质进入孔内，因而在柱中滞留时间较长，大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出，因此不同大小的蛋白质得以分离

蛋白质颗粒沉降行为与超速离心分离

超速离心法既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。

蛋白质的一级结构分析

• 离子交换层析分析蛋白质的氨基酸组分：首先分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成
• 测定多肽链的氨基端与羧基端为何种氨基酸残基
  • 测定多肽链的氨基端和羧基端的氨基酸残基
  • 用二硝基氟苯与多肽链的α-氨基作用生成二硝基苯氨基酸,然后将多肽水解,分离出带有二硝基苯基的氨基酸
  • 羧基端氨基酸残基可用羧肽酶将其水解下来进行鉴定
• 肽链序列的测定：将肽链水解成片段,分别进行分析

蛋白质的空间结构分析

• 圆二色光谱法测定蛋白质二级结构
• 蛋白质三维空间结构解析
  • X射线衍射：首先将蛋白质制备成晶体,X射线射至蛋白质晶体上,产生不同方向的衍射,收集衍射光束所产生的电子密度图,可计算出空间结构
  • 核磁共振：主要用于测定蛋白质的液相三维空间结构
  • 冷冻电镜：可以分析蛋白质在相对天然状态下的结构
• 生物信息学预测蛋白质空间结构：可以根据蛋白质的一级结构,参照已经完成的各种蛋白质的三维结构数据库进行预测

生物大分子相互作用研究技术

• 蛋白质相互作用研究技术：标签蛋白沉淀、酵母双杂交技术
• DNA-蛋白质相互作用分析技术：电泳迀移率变动分析、染色质免疫沉淀技术