基因诊断
- 基因诊断的概念及特点
- 基因诊断是针对DNA和RNA的分子诊断
- 绝大部分疾病的表型是由基因结构及其功能异常或外源性病原体基因的异常表达造成的,这也是疾病发生的根本原因
- 基因诊断不依赖疾病表型改变,直接以致病基因、疾病相关基因、外源性病原体基因或其表达产物为诊断对象,具有特异性强、灵敏度高、可早期诊断、应用性广的独特优势
- 基因诊断在疾病诊断上具有独特的优势：以遗传物质作为诊断目标,可以在临床症状和表型发生改变前作出早期诊断,属于病因诊断,并且基因诊断的结果还能够提示疾病发生的分子机制
- 基因诊断的样品来源广泛
- 基因诊断的基本技术日趋成熟
- 定性分析
- 基因分型、检测基因突变
- 可诊断外源感染性病原体基因在人体存在与否
- 定量分析
- 测定基因拷贝数及基因表达产物量
- 可确定外源感染性病原体基因含量
- 常用于基因诊断的基本方法主要有核酸分子杂交技术、PCR、DNA测序和基因芯片技术等
- 核酸分子杂交技术是基因诊断的基本方法：DNA印迹法、Northern印迹法、斑点杂交、原位杂交、荧光原位杂交
- PCR技术能够极其快速、特异性地在体外进行基因或DNA片段的扩增,具有较高的灵敏度
- 直接采用PCR技术进行基因诊断
- PCR技术是特异、快速的基因诊断方法
- PCR-等位基因特异性寡核苷酸分子杂交
- PCR-限制性片段长度多态性
- PCR-单链构象多态性
- DNA序列分析是基因诊断最直接的方法：主要用于基因突变类型已经明确的遗传病的诊断及产前诊断
- 基因芯片技术可用于大规模基因诊断：基因芯片技术可以进行微量化、大规模、自动化处理样品,特别是适用于同时检测多个基因、多个位点,精确地研究各种状态下分子结构的变异,了解组织或细胞中基因表达情况,用以检测基因的突变、多态性、表达水平和基因文库作图等
- 定性分析
- 基因诊断的医学应用
- 基因诊断可用于遗传性疾病诊断和风险预测
- 基因诊断可用于多基因常见病的预测性诊断
- 基因诊断可用于传染病病原体检测
- 基因诊断可用于疾病的疗效评价和用药指导
- DNA指纹鉴定是法医学个体识别的核心技术
基因治疗
- 基因治疗
- 是以改变人遗传物质为基础的生物医学治疗，即通过一定方式将人正常基因或有治疗作用的 DNA 片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法。
目的基因被导入靶细胞内，它们或与宿主细胞染色体整合成为宿主细胞遗传物质的一部分，或不与宿主细胞的染色体整合而独立于染色体以外，但都可以在宿主细胞内表达基因产物蛋白质，而达到治疗作用。
基因治疗的基本策略
- 缺陷基因精确的原位修复：
- 包括对致病基因的突变碱基进行纠正的基因矫正（gene correction）和用正常基因通过重组原位替换致病基因的基因置换
- 这两种方法均属于对缺陷基因精确的原位修复,既不破坏整个基因组的结构,又可达到治疗疾病的目的,是最为理想的治疗方法
- 基因增补
- 不删除突变的致病基因,而在基因组的某一位点额外插入正常基因,在体内表达出功能正常的蛋白质,达到治疗疾病的目的。这种对基因进行异位替代的方法称为基因添加或称基因增补,是目前临床上使用的主要基因治疗策略
- 基因增补不仅可以用于替代突变基因,也可以在原有基因表达水平不足以满足机体需要的情况下,异位过表达来增强体内某些功能
- 基因沉默或失活
- 向病人体内导入有抑制基因表达作用的核酸,如反义RNA、核酶、干扰小RNA等,可降解相应的mRNA或抑制其翻译,阻断致病基因的异常表达,从而达到治疗疾病的目的,这一策略称为基因失活或基因沉默,也称为基因干预
- 需要抑制的靶基因往往是过度表达的癌基因或者是病毒复制周期中的关键基因
- 自杀基因
- 自杀基因治疗肿瘤的原理是将编码某些特殊酶类的基因导入肿瘤细胞,其编码的酶能够使无毒或低毒的药物前体转化为细胞毒性代谢物,诱导细胞产生“自杀”效应,从而达到清除肿瘤细胞的目的
基因治疗的基本程序
- 选择治疗基因
- 分泌性蛋白质：如生长因子、多肽类激素、细胞因子、可溶性受体(人工构建的去除膜结合特征的受体)
- 非分泌性蛋白质：如受体、酶、转录因子的正常基因
- 选择携带治疗基因的载体
- 包括病毒载体和非病毒载体
- 目前用作基因转移载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒等
- 选择基因治疗的靶细胞
- 基因治疗所采用的靶细胞通常是体细胞,包括病变组织细胞或正常的免疫功能细胞
- 目前能成功用于基因治疗的靶细胞主要有造血干细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、肌细胞和肿瘤细胞等
- 在细胞和整体水平导入治疗基因
- 基因递送
- 直接体内疗法：即将外源基因直接注入体内有关的组织器官,使其进入相应的细胞并进行表达
- 间接体内疗法：即先将需要接受基因的靶细胞从体内取出,在体外培养,将携带有治疗基因的载体导入细胞内,筛选出接受了治疗基因的细胞,繁殖扩大后再回输体内,使治疗基因在体内表达相应产物
- 基因导入细胞的方法
- 生物学法：指的是病毒载体所介导的基因导入,是通过病毒感染细胞实现的,其特点是基因转移效率高,但安全问题需要重视
- 非生物学法：是用物理或化学法,将治疗基因表达载体导入细胞内或直接导入人体内,操作简单、安全,但是转移效率低
- 基因递送
- 治疗基因表达的检测
- 被导入基因的表达状态可以用PCR、RNA印迹、蛋白印迹及ELISA等方法检测
- 导入基因是否整合到基因组以及整合的部位,可以用核酸杂交技术进行分析