逆转录、qPCR 与琼脂糖凝胶电泳

  • Published on 2024-10-25
  • Modified on 2024-11-01
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RT-PCR = 逆转录 + PCR 或 qPCR（Real-time PCR）

  • RT-PCR：逆转录 PCR
  • qPCR：定量（quantitative）PCR
  • Real-time PCR：即时 PCR

逆转录

逆转录 | 反转录
在逆转录酶和引物的作用下，以样本中提取的 RNA 为模板，合成出 cDNA（complementary DNA，互补 DNA）。

逆转录酶

逆转录酶有三种活性：

  • RNA 指导的 DNA 聚合酶活性（RNA → DNA）：RNA 指导的 DNA 聚合，逆转录的关键；
  • RNase H（Hybrid）活性：水解杂化双链中的 RNA 单链，还会和聚合酶活性竞争样品中的 RNA 与引物或 cDNA 延伸链形成的杂合双联；
  • DNA 指导的 DNA 聚合酶活性（DNA → DNA）：DNA 模板也可直接用于/参与逆转录，所以要用 DNase 去除样品中的 DNA。

在选择逆转录酶时，建议选择无 RNaseH 活性（RNaseH-）的逆转录酶。具有 RNaseH 活性的逆转录酶的 RNaseH 活性会与聚合酶活性竞争 RNA 模板与 DNA 引物（或 cDNA 延伸链）形成的杂合链，并降解杂合链中的 RNA 链。被 RNaseH 活性所降解的 RNA 模板不能再作为合成 cDNA 的有效底物，降低了 cDNA 合成的产量与长度。

引物

用于反转录的引物有随机引物、通用引物（Oligo-dT）及基因特异性引物三种，下表为三种引物的介绍：

常见的三种引物

引物适用范围
随机引物适用于长的或具有发卡结构的 RNA。适用于 rRNA、mRNA、tRNA 等所有 RNA 的反转录
反应。主要用于单一模板的 RT-PCR 反应
Oligo-dT适用于具有 PolyA 尾巴的 RNA（原核生物的 RNA、真核生物的 rRNA 和 tRNA 不具有
PolyA 尾巴）
基因特异性引物与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况
Oligo-dT

Oligo-dT

  • Oligo-dT 需要 RNA 有 PolyA 尾，即需要 RNA 结构完整。

qPCRReal-time PCR

即时聚合酶链式反应是一种在 DNA 扩增反应中，以荧光染剂侦测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量的方法。

  • “荧光染剂”：如 SYBR Green，其在结合双链 DNA 时会发出荧光。PCR 扩增过程中，随着 DNA 的合成，SYBR Green 与新合成的双链 DNA 结合，从而增加荧光信号的强度。
  • “Real-time”：在每个 PCR 循环结束时，荧光信号的强度被实时测量。通过监测荧光信号的变化，可以在反应的早期阶段判断 PCR 扩增的进程。
  • “q（quantitative）”：通过与标准曲线进行比较，SYBR Green 可以帮助定量样本中目标 DNA 的初始浓度。荧光信号的强度与 DNA 的量成正比。

qPCR 结果评价指标：

  1. CT（cycle threshold）：指扩增过程中，荧光信号首次达到设定阈值的循环数。换句话说，就是检测到显著荧光信号所需的 PCR 循环次数。
    • CT 值与初始模板浓度成反比。
    • CT 值 SD 应 < 0.05。
  2. 扩增曲线（amplification plot）：指PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线。理想的扩增曲线应呈现出光滑的 S 型曲线（扩增曲线 log 图则不然）：
    扩增曲线示意图

    扩增曲线示意图

  3. 熔解曲线（求导曲线）：在循环扩增结束后，再设置一段由65℃逐渐升温到95℃（具体温度可能要视情况而定）的程序。随着 DNA 解链变性，荧光染剂从 DNA 中释放，导致荧光信号降低。
    • 普通的溶解曲线是逐渐下降的 S 形曲线，Y 轴是荧光信号强度。
    • 通常所说的溶解曲线是指普通溶解曲线的负一阶导数曲线，Y 轴是指熔解曲线的荧光信号强度随温度变化的斜率的负值。这个曲线中的峰对应的温度即为解链温度 Tm——一半 DNA 变性时的温度。
      溶解曲线

      溶解曲线

qPCR 数据分析：

https://www.bilibili.com/video/BV1eU4y1o7uR

$$\Delta CT_{目的} = CT_{目的}-Mean(CT_{内参}) \,.$$$$\Delta \Delta CT_{实验组目的} = \Delta CT_{实验组目的}-Mean(\Delta CT_{对照组目的}) \,.$$

最后得到目的基因相对表达量：

$$RelExpr = 2^{-\Delta \Delta CT_{实验组目的}} \,.$$

另一种方法：

$$X = 2^{-(CT_{目的}-CT_{内参})} \,.$$$$Y = X - Mean(X) \,.$$

应该满足：各组的 $Mean(Y)=1$。

各实验组计算相对表达量：

$$RelExpr = Mean(X - Mean(X_{对照})) \,.$$

梯度 PCR

琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖
  • 琼脂糖是琼脂的一种成分，它形成了一个由螺旋状的琼脂糖分子组成的三维凝胶基质，这些螺旋状的琼脂糖分子在超线圈束中被氢键固定，有通道和孔隙，分子能够通过。当加热时，这些氢键断裂，使琼脂糖变成液体，并允许它在复位前被倒入模具。
  • 琼脂糖在凝胶中的百分比影响了孔的大小，从而影响了可能通过的分子的大小以及通过的速度。琼脂糖的百分比越高，孔径越小，因此能够通过的分子越小，迁移速度越慢。
  • 在分子生物学实验室中，0.7–1% 的琼脂糖凝胶通常用于日常的 DNA 分离，对 0.2–10kb 范围内的片段提供良好、清晰的区分。较大的片段可以用较低百分比的凝胶来解决，但它们会变得非常脆弱且难以处理，而较高百分比的凝胶会对小片段提供更好的分辨率，但很脆且可能凝固不均匀。
溴化乙锭
  • 由于 DNA 在肉眼中是不可见的，在凝固过程中，会向凝胶中加溴化乙锭（EthBr）。EthBr 是一种嵌入剂，当暴露在紫外线下时，它会发出橙色萤光，与 DNA 结合后强度增强近 20 倍。

步骤

  1. 1.2g 琼脂糖粉末，80ml TAM（用 dd 水配成 1x），混匀，用锡纸封口，微波炉加热 2min
  2. 稍冷却（注意不要凝固了）之后加入 8ul（1/10000）SYBR 显影剂
  3. 胶板与模具板装好，倒入胶液，两头胶板与模具板之间见到溢出提示量足够
  4. 冷却后去除胶板，放入电泳池，加 TAM 至没过胶面 5mm 左右
  5. 计算：之前 qPCR 的 96 孔板，每一组（比如 造模后 0h 的 内参组）选择比较一致的至少 3 个孔，数量为 N。
  6. 准备一张封口胶，在上面加 loading buffer 1ul x N（注意第二挡不要按到底，以免产生气泡影响后续操作），每滴加 cDNA 溶液（“计算”中选择的孔）10ul 混匀，加入上样孔
  7. 开始电泳，约 120V 35min（电压过高可能导致凝胶熔化）。
  8. 使用紫外光显影 DNA 条带（溴化乙锭 EthBr）（注意防护）（或者直接观察 SYBR 荧光？）。
实验笔记