蛋白质免疫共沉淀(IP)
样品处理
高速离心沉淀细胞,吸弃上清 200μl 细胞裂解液(预加入蛋白酶抑制剂),吹打,冰上放置 15min (细菌原核生物表达:需要超声波处理) 离心,沉淀细胞碎片,取上清,放置冰上备用
准备磁珠
20μl 磁珠到干净(无酶?)离心管备用。 200μl洗涤缓冲液(PBS 还是 IP wash buffer),置于磁力架磁力架收集磁珠。磁珠被吸引到一边时,吸弃上清。(再?)重复洗涤 2 次。
结合抗体
加入10-20ug 抗体(用量取决于抗体本身,预实验摸索)。 加入 200μl 洗涤缓冲液,旋转仪室温孵育 30min。 吸取上清,保留其中未结合的样本用于后续分析。 洗涤磁珠 3 次,方法同前(洗涤上清可丢弃也可留取分析)。
共沉淀
向磁珠中加入细胞裂解液(前面裂解之后的上清)(留取部分裂解液作为 input?用于后续分析),旋转仪室温孵育 10-15min。 洗涤磁珠 5 次,方法同前。
洗脱
加入 100μl 蛋白上样缓冲液,95°C 水浴 5 min。 磁力架上分离 10s,取上清用于 SDS-PAGE 或 Western 检测。
RNA 免疫共沉淀(RIP)
lncRNA 会干扰 RNA 与 RBP 的结合。
样品处理
- 1ml 裂解液,混匀,冰上 30min(每 10min 涡旋混匀,10s/次)。
- 超声裂解 1-3min。
- 离心 4°C12000rpm5min,取上清,4°C 保存备用。
准备磁珠
- 将磁珠(Magnetic Beads Protein A/G)原管混匀(上下颠倒 10 次,涡旋 1 次),分别取 50μl 到标记为 IgG 和 IP 的无酶 1.5 ml 离心管中。
- (3x)各加 500μl 洗涤缓冲液(RIP wash buffer),涡旋,磁力架,磁力架上静置 1min,弃上清。
- 300μl 洗涤缓冲液重悬。
结合抗体
- IP 管加入 3-6μg 目的抗体;IgG 管加入 3-6ug 与目的抗体宿主相同的 IgG。静音混合仪(摇床可以吗?)室温孵育 1-2h。
- 离心机常温 2000rpm2min。
- 磁力架静置 1min,弃上清。
- 洗涤 3 次,方法同前。
共沉淀
整个孵育体系在 500-1000μl 间。
免疫沉淀孵育液
1. 460μl RIP 洗涤缓冲液
- 35μl 0.5M EDTA
- 3μl RNA 酶抑制剂
- 向磁珠中加入孵育液(每管都是上述剂量?)。
- 每管加入 300-500μl 蛋白裂解液(第 1 步的上清),涡旋混匀,静音混合仪上 4°C 孵育过夜。
洗脱
- 离心,室温 2000rpm2min,磁力架静置 1min。
- 液体蛋白回收到两管中(?)。
- (3x)500μl wash buffer 重悬磁珠,涡旋混匀,磁力架静置 1min,弃上清。
- 300μl wash buffer 重悬磁珠。
- 每管各取 1/3 移到新管(无酶 1.5ml 离心管),剩余 2/3 责继续纯化 RNA。
- 每管加入 30μl 洗脱液。
- 沸水浴 10min(使磁珠与蛋白分离)
- 磁力架静置 1min,取上清。
- 加入总体积 1/6(上清的 1/5?)的 6X loading buffer,用于 WB 检测。
RNA 纯化
蛋白酶 K 缓冲液(共 150μl)
- 117μl 洗涤液
- 15μl 10%SDS
- 18μl 蛋白酶 K
RNA 沉淀增强剂
- 25μl 盐溶液 I
- 7.5μl 盐溶液 II
- 2.5μl 沉淀增强剂
- 425μl 无水乙醇
- 前述剩余液体中加入 150μl 蛋白酶 K 缓冲液,涡旋仪振荡混匀,55°C 水浴 30min(去除蛋白质)。
- 每管加入 500μl Trizol 和 100μl 氯仿混合液,混匀。
- 离心,4°C12000rpm5min
- 提取上层水相到新无酶管中
- 每管上清中加入 500μl RNA 沉淀增强剂
- -80°C 冰箱反应 2-3h
- 离心,4°C14000rpm30min
- 弃去上清(吸取干净),每管沉淀加入 500μl 80% 乙醇
- 离心,4°C14000rpm10min,弃去上清
- 室温晾干,每管加入 10-20μl DEPC 水,吹打
- -80°C 保存,后用于 qPCR 检测