蛋白质免疫共沉淀（IP）

样品处理

高速离心沉淀细胞，吸弃上清 200μl 细胞裂解液（预加入蛋白酶抑制剂），吹打，冰上放置 15min （细菌原核生物表达：需要超声波处理） 离心，沉淀细胞碎片，取上清，放置冰上备用

准备磁珠

20μl 磁珠到干净（无酶？）离心管备用。 200μl洗涤缓冲液（PBS 还是 IP wash buffer），置于磁力架磁力架收集磁珠。磁珠被吸引到一边时，吸弃上清。（再？）重复洗涤 2 次。

结合抗体

加入10-20ug 抗体（用量取决于抗体本身，预实验摸索）。 加入 200μl 洗涤缓冲液，旋转仪室温孵育 30min。 吸取上清，保留其中未结合的样本用于后续分析。 洗涤磁珠 3 次，方法同前（洗涤上清可丢弃也可留取分析）。

共沉淀

向磁珠中加入细胞裂解液（前面裂解之后的上清）（留取部分裂解液作为 input？用于后续分析），旋转仪室温孵育 10-15min。 洗涤磁珠 5 次，方法同前。

洗脱

加入 100μl 蛋白上样缓冲液，95°C 水浴 5 min。 磁力架上分离 10s，取上清用于 SDS-PAGE 或 Western 检测。

RNA 免疫共沉淀（RIP）

样品处理

1. 1ml 裂解液，混匀，冰上 30min（每 10min 涡旋混匀，10s/次）。
2. 超声裂解 1-3min。
3. 离心 4°C12000rpm5min，取上清，4°C 保存备用。

准备磁珠

1. 将磁珠（Magnetic Beads Protein A/G）原管混匀（上下颠倒 10 次，涡旋 1 次），分别取 50μl 到标记为 IgG 和 IP 的无酶 1.5 ml 离心管中。
2. （3x）各加 500μl 洗涤缓冲液（RIP wash buffer），涡旋，磁力架，磁力架上静置 1min，弃上清。
3. 300μl 洗涤缓冲液重悬。

结合抗体

1. IP 管加入 3-6μg 目的抗体；IgG 管加入 3-6ug 与目的抗体宿主相同的 IgG。静音混合仪（摇床可以吗？）室温孵育 1-2h。
2. 离心机常温 2000rpm2min。
3. 磁力架静置 1min，弃上清。
4. 洗涤 3 次，方法同前。

共沉淀

整个孵育体系在 500-1000μl 间。

1. 向磁珠中加入孵育液（每管都是上述剂量？）。
2. 每管加入 300-500μl 蛋白裂解液（第 1 步的上清），涡旋混匀，静音混合仪上 4°C 孵育过夜。

洗脱

1. 离心，室温 2000rpm2min，磁力架静置 1min。
2. 液体蛋白回收到两管中（？）。
3. （3x）500μl wash buffer 重悬磁珠，涡旋混匀，磁力架静置 1min，弃上清。
4. 300μl wash buffer 重悬磁珠。
5. 每管各取 1/3 移到新管（无酶 1.5ml 离心管），剩余 2/3 责继续纯化 RNA。
6. 每管加入 30μl 洗脱液。
7. 沸水浴 10min（使磁珠与蛋白分离）
8. 磁力架静置 1min，取上清。
9. 加入总体积 1/6（上清的 1/5？）的 6X loading buffer，用于 WB 检测。

RNA 纯化

1. 前述剩余液体中加入 150μl 蛋白酶 K 缓冲液，涡旋仪振荡混匀，55°C 水浴 30min（去除蛋白质）。
2. 每管加入 500μl Trizol 和 100μl 氯仿混合液，混匀。
3. 离心，4°C12000rpm5min
4. 提取上层水相到新无酶管中
5. 每管上清中加入 500μl RNA 沉淀增强剂
6. -80°C 冰箱反应 2-3h
7. 离心，4°C14000rpm30min
8. 弃去上清（吸取干净），每管沉淀加入 500μl 80% 乙醇
9. 离心，4°C14000rpm10min，弃去上清
10. 室温晾干，每管加入 10-20μl DEPC 水，吹打
11. -80°C 保存，后用于 qPCR 检测